热打击诱导氧化应激介导神经元凋亡过程中核因子κB的活化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (11): 1641-1646.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.001

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热打击诱导氧化应激介导神经元凋亡过程中核因子κB的活化

刘云松¹，邓旭斌²，霍少芬²，苏磊³

¹南方医科大学研究生院，解放军广州军区广州总医院重症医学科，广东省广州市 510010；²南方医科大学肿瘤研究所，广东省广州市 510010；³解放军广州军区广州总医院重症医学科，广东省广州市 510010

修回日期:2014-01-03 出版日期:2014-03-12 发布日期:2014-03-12
通讯作者: 苏磊，博士，主任医师，解放军广州军区广州总医院重症医学科，广东省广州市 510010
作者简介:刘云松，男，1972年生，江西省南昌市人，汉族，1995年解放军第一军医大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事热射病相关脑损害研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81071529，81101467)；全军十二·五重点课题(BWS12J018)

Activation of nuclear factor kappa B during heat stress-induced neuronal apoptosis

Liu Yun-song¹, Deng Xu-bin², Huo Shao-fen², Su Lei³

¹Graduate School, Southern Medical University, Department of Critical Care Medicine, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China; ²Cancer Research Institute, Southern Medical University, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China; ³Department of Critical Care Medicine, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China

Revised:2014-01-03 Online:2014-03-12 Published:2014-03-12
Contact: Su Lei, M.D., Chief physician, Department of Critical Care Medicine, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China
About author:Liu Yun-song, Master, Associate chief physician, Graduate School, Southern Medical University, Department of Critical Care Medicine, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071529, 81101467; Military Key Project during the Twelfth Five-Year Plan, No. BWS12J018

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量研究显示高热可诱导机体细胞发生广泛凋亡，但对于高热如何介导神经元细胞凋亡并没有深入研究报道。

目的：检测热打击细胞模型中核因子κB信号通路对活性氧诱导细胞凋亡的影响。

方法：使用细胞培养箱建立细胞热打击模型，热打击组分别将细胞置于39，41，43 ℃培养箱中进行热打击2 h，对照组(37 ℃组)将细胞置于标准37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱。使用Annexin V-FITC/PI双染色方法检测不同温度热打击下神经元细胞凋亡率，Westen blot 检测caspase-3及抗-核因子КB65蛋白表达，DCFH法检测细胞内活性氧含量，同时检测活性氧抑制剂MnTMPyP及核因子κB抑制剂PDTC对热打击细胞凋亡的影响。

结果与结论：39 ℃热打击对细胞凋亡无影响，41 ℃热打击诱导细胞少量凋亡(10.19%)，43 ℃热打击诱导诱导细胞大量凋亡(43.02%)。caspase-3和抗-核因子κB65蛋白的表达于热打击温度依赖的方式增加。MnTMPyP及PDTC均可有效阻断热打击引起的caspase-3、抗-核因子κB65蛋白的表达和细胞凋亡。结果证实热打击后细胞内活性氧增加诱导神经元细胞凋亡，提示核因子κB可能作为中间信号通路参与了热打击引起的细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 热打击, 神经元, 细胞凋亡, 核因子κB, 活性氧, caspase-3, 抗-核因子κB65蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hyperpyrexia can induce a wide range of cell apoptosis in organisms, but no study has introduced the mechanism of heat stress-induced neuronal apoptosis.

OBJECTIVE: To observe the effect of nuclear factor kappa B (NF-κB) signal pathway on heat stress-induced neuronal apoptosis through reactive oxygen species.

METHODS: Heat stress model was established in the cell incubator. Heat stress group of cells were incubated at 39, 41, 43 ℃ for 2 hours, while control group of cells were incubated at 37 ℃ in 5% CO₂ for 2 hours. Apoptosis was analyzed by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining. The expression levels of caspase-3 and p-NF-κB65 were determined by western blot analysis. The amounts of intracellular reactive oxygen species were assayed by DCFH staining. In addition, the effect of MnTMPyP and PTDC on heat stress-induced apoptosis was also studied.

RESULTS AND CONCLUSION: 39 ℃ heat stress had no impact on the apoptosis, 41 ℃ heat stress induced a small amount of apoptosis (10.19%), and 43 ℃ heat stress triggered a large amount of apoptosis (43.02%). The expression of caspase-3 and p-NF-κB65 was increased, in a temperature-dependent manner. In addition, both MnTMPyP and PTDC significantly decreased the heat stress-induced apoptosis and expression of caspase-3 and p-NF-κB65. Experimental findings indicate that, the increase of intracellular reactive oxygen species may induce neuronal apoptosis, and NF-κB participates in the heat stress-induced neuronal apoptosis as the intermedial signal pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: heat stroke, apoptosis, NF-kappa B

中图分类号:

R394.2

刘云松，邓旭斌，霍少芬，苏磊. 热打击诱导氧化应激介导神经元凋亡过程中核因子κB的活化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1641-1646.

Liu Yun-song, Deng Xu-bin, Huo Shao-fen, Su Lei. Activation of nuclear factor kappa B during heat stress-induced neuronal apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1641-1646.

图/表（结果） 2

2.1 热打击后神经元细胞凋亡、凋亡相关蛋白caspase-3及核转录因子抗-磷酸化核因子κB65蛋白表达 不同温度热打击后使用流式细胞仪检测神经元细胞凋亡率，发现热打击组39 ℃对凋亡无影响，而随着热打击温度的增加神经元细胞凋亡逐渐增多，41 ℃凋亡率为10.19%，43 ℃凋亡率急剧上升到43.02%，与对照组37 ℃比较，热打击组41 ℃和43 ℃神经元细胞凋亡率差异有显著性意义(P < 0.01，图1A)。Westen blot检测凋亡关键蛋白caspase-3及核转录因子抗-磷酸化核因子κB65的表达发现，随着热打击温度的增加caspase-3及抗-磷酸化核因子κB65蛋白的表达逐渐增强，其表达趋势与神经元细胞凋亡一致(图1B)。

2.2 不同温度热打击后神经元细胞内活性氧水平检测结果 使用DCFH-DA法检测不同温度热打击后细胞内活性氧水平，热打击神经元细胞2 h后继续在细胞培养箱孵育12 h。发现与对照组37 ℃比较，热打击39 ℃对细胞内活性氧水平无影响，而随着热打击强度的增加，细胞内活性氧水平明显增加，41 ℃和43 ℃热打击分别增加了近7倍和15倍(与对照组37 ℃比较，图2)。

2.3 检测活性氧特异性清除剂MnTMPyP对不同温度热打击后细胞凋亡、凋亡相关蛋白caspase-3及核转录因子抗-磷酸化核因子κB65蛋白表达的影响 结果显示MnTMPyP可明显抑制热打击引起的细胞凋亡，与单纯43 ℃热打击组(47.42%)相比，MnTMPyP+43 ℃热打击细胞凋亡率(18.45%)明显减少，两组比较差异有显著性意义(P < 0.01，图3A)。Westen blot检测发现，43 ℃热打击组活化凋亡相关蛋白caspase-3及抗-磷酸化核因子κB65蛋白表达明显增强，MnTMPyP预处理后明显抑制了caspase-3及抗-磷酸化核因子κB65蛋白的表达(P < 0.01，图3B，C)

2.4 核因子κB活性抑制剂PDTC对热打击诱导细胞凋亡的影响 结果显示：与单纯43 ℃热打击组(41.67%)相比，PDTC预处理后神经元细胞凋亡率(11.20%)明显减少，两组比较差异有显著性意义(P < 0.01，见图4A)。同样，PDTC也明显抑制了热打击诱导的活化caspase-3蛋白的表达(图4B)。

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引言

中暑是在高温伴高湿或烈日暴晒过久的环境下，由于中枢性体温调节功能障碍，机体体温调节障碍，水、电解质代谢紊乱及神经系统功能损害而发生的一组急性热病。表现为中心体温升高超过40 ℃以及中枢神经系统功能障碍而引起谵妄、惊厥或者昏迷等症状^[1]，在高温季节和地区是一种常见病^[2]。流行病学显示中国重症中暑死亡率在10%-15%^[3]，合并多器官功能障碍综合征者死亡率高达40%以上，即便是存活的患者也有30%以上遗留神经、骨骼肌等系统的后遗症^[4-5]，其中由高温和热辐射引起的中枢神经系统损害是中暑的主要特征之一，其损害程度也直接决定了中暑的病情及预后^[5-6]。

目前，中暑中枢神经系统损害的病理生理机制尚不明确。随着对高热诱导机体损伤认识的不断深入，凋亡在热相关性疾病的作用越来越受到重视^[7-8]。越来越多的证据显示，高热诱导机体细胞损伤程度与热的程度相关，极度高温(当环境温度达到49-50 ℃以上)可导致细胞在5 min内以坏死方式死亡，而当环境温度在41.6-42 ℃时，细胞死亡方式以凋亡为主^[9-10]。因此高热诱导的细胞凋亡在热相关性疾病，尤其是中暑或重症中暑发病过程中可能发挥了重要的作用。目前尚无动物模型支持高热诱导中枢神经细胞凋亡的报道，而国外Vogel观察到了热刺激后神经元细胞凋亡的证据^[11]。迄今为止，尚无高热诱导神经元细胞凋亡的更深一步研究。

动物实验研究显示，高热可诱导大脑产生过多的氧自由基，从而诱导脑部氧化应激反应为主的损伤效应^[12]，这可能是中暑患者中枢神经损害的原因之一。目前研究已证实，氧自由基水平增高可作为上游启动信号，激活细胞凋亡通路，从而介导细胞凋亡^[13-14]。热应激诱导的氧自由基水平爆发性增加诱导细胞凋亡也已在体外细胞实验中被证实^[15-17]。核因子κB是一种广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子，能介导广泛的生物学作用，参与多种疾病的发生发展过程^[18]。研究已发现大脑皮质和海马神经元内含有高结构型活性的核因子κB，其可能参与了代谢活跃的神经元中抗氧化系统的调节^[19]。中枢神经系统内存在的细胞因子(肿瘤坏死因子α，白细胞介素1)、氧化应激、紫外线、细菌和病毒产物等可激活核因子κB信号通路^[20]。目前有关核因子κB是诱导细胞死亡还是促进细胞存活仍存在争论^[21]。热打击可导致大脑皮质发生过度的氧化应激反应及神经元细胞凋亡已在动物和体外细胞实验中证实^[11-22]，但目前没有进一步深入的研究报道。实验设想高热诱导了大脑神经元细胞凋亡与氧自由基以及核因子κB的活化相关，研究中暑中枢神经系统损伤的病理机制。

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材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2012年7月至2013年5月在南方医科大学肿瘤研究所和南方医科大学公共卫生与热带卫生学学院模拟热气候动物仓完成。

材料：

实验方法：

SD大鼠大脑皮质神经元细胞株培养：培养液由含 600 g/L葡萄糖的DMEM加体积分数10%马血清、终浓度为100 mg/L的转铁蛋白、5 mg/L胰岛素、20 nmol孕酮、 100 μmol/L腐胺、30 nmol/L二氧化硒及100 U/mL双抗组成，将SD大鼠大脑皮质神经元细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度条件的孵箱中培养。两三天进行1次传代，传代按1∶2-1∶3的比例进行。细胞长至对数生长期后进行实验。

Annexin V/PI流式细胞仪检测细胞凋亡：实验分为2组：热刺激组将细胞分别置于39 ℃、41 ℃、43 ℃ 2 h；对照组37 ℃ 2 h。热刺激后继续在细胞培养箱孵育12 h。使用Annexin V/PI试剂盒，按说明书进行操作。

在不同时间点收集细胞，调整待检测细胞浓度为 1×10⁹L^-1，用冰PBS润洗2次，将细胞重悬于100 μL含2 μL Annexin-V-FITC(20 mg/L)的缓冲液中轻轻混匀，避光室温放置15 min。转至流式检测管，加入400 μL PBS，每个样品临上机前加入1 μL PI(50 mg/L)，2 min后迅速检测。流式细胞仪检测激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。

Westen blot 检测磷酸化caspase-3和抗-磷酸化核因子κB65蛋白表达：Westen blot参考文献说明进行^[23]。一抗使用Rabbit抗-caspase-3激活型抗体(1∶1 000)、Rabbit抗-磷酸化核因子κB抗体(1∶500)。二抗使用山羊抗兔HRP标记IgG(1∶5 000)。抗体孵育完成后使用化学发光剂ECL进行反应、显影、压片。Westen blot检测caspase-3及抗-核因子κB65蛋白表达，DCFH法检测细胞内活性氧含量。对照组和热打击组神经元细胞在进行热刺激处理前使用浓度为10 μmol/L的MnTMPyP预处理1 h，热打击2 h后继续培养12 h。

为了证实核因子κB信号通路在热打击诱导细胞凋亡中的作用，对照组和热打击组神经元细胞在进行热刺激处理前使用20 μL PTDC预处理30 min，热打击2 h后继续培养12 h。检测活性氧抑制剂MnTMPyP及核因子κB抑制剂PDTC对热打击细胞凋亡的影响。

细胞内活性氧检测：使用DCFH-DA法检测细胞内活性氧，按照说明书操作，分别收集热刺激组及对照组细胞，用终浓度10 μmol/L的DCFH-DA分子探针悬浮收集后的细胞，细胞浓度调整为1×10¹⁰L^-1，并将细胞置入37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔3-5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。热刺激组将细胞分别置于39 ℃、41 ℃、43 ℃ 2 h，对照组细胞置于37 ℃ 2 h，热刺激后继续在细胞培养箱孵育12 h。使用激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=525 nm检测荧光的强弱。

主要观察指标：①热打击后神经元细胞凋亡、凋亡相关蛋白caspase-3及核转录因子抗-磷酸化核因子κB65蛋白表达。②不同温度热打击后神经元细胞内活性氧水平。③活性氧特异性清除剂MnTMPyP对不同温度热打击后细胞凋亡、凋亡相关蛋白caspase-3及核转录因子抗-磷酸化核因子κB65蛋白表达。④核因子κB活性抑制剂PDTC对热打击诱导细胞凋亡的影响。

统计学分析：使用Graphpad Prism 及SPSS 17.0统计软件进行统计分析，服从或近似正态分布的计量资料用 x(_)±s表示，组间比较采用oneway anova，计数资料以百分率表示，采用χ²检验进行比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

高温和热辐射诱导神经元细胞凋亡作用已经在体外实验中得到证实^[11]，但目前针对热打击诱导神经元细胞凋亡的机制研究较少，该过程与细胞内活性氧水平及核因子κB信号通路的关系国内外未见报道。实验发现不同温度热打击后神经元细胞凋亡与细胞内活性氧水平及核因子κB活化密切相关，并且热打击后细胞内活性氧水平爆发性增加可能通过核因子κB信号通路介导神经元细胞凋亡。

核因子κB广泛存在于静止期细胞的细胞质中，其蛋白二聚体与特异性抑制蛋白IκB形成三聚体，以非活化形式存在于细胞质。当细胞受到如氧化应激、感染或辐射等刺激后，IκB发生磷酸化失活，使核因子κB活化，进入细胞核内，启动或调节早期反应基因的转录，参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡等^[24-28]。Kim等^[19]在2000年首次发现在神经元中存在核因子κB，并且发现与大多数外周细胞不同，大脑皮质神经元细胞含有高结构型活性的核因子κB。此后研究发现核因子κB在神经细胞凋亡的网络中起着枢纽作用^[29-32]。但活化的核因子κB是抗凋亡还是促凋亡作用迄今仍存在争论^[21^，^33-34]。实验发现热打击神经元细胞后抗-磷酸化核因子κB65表达呈温度依赖性增强，并且与细胞凋亡及caspase-3的活化一致。使用核因子κB抑制剂PTDC可明显抑制这一趋势，提示核因子κB活化介导了热打击神经元细胞的凋亡。作为凋亡枢纽，热打击诱导核因子κB活化的上游信号尚不明确。

近年来许多研究已证实热打击可以导致细胞内活性氧水平爆发性增加，并且认为其与热打击的细胞凋亡密切相关^[35-36]。实验使用MnTMPyP(活性氧特异性清除剂)干预了热打击后神经元细胞内活性氧的水平后发现，MnTMPyP 在明显抑制热打击诱导抗-磷酸化核因子κB65表达的同时，也明显抑制了caspase-3的活化以及凋亡的发生。提示在热打击细胞模型中，活性氧通过中间枢纽核因子κB信号通路介导神经元细胞凋亡。

以上研究表明尽管活化的核因子κB在凋亡中具有双重作用，但重度热打击后核因子κB活化促进了神经元细胞凋亡，并且热打击诱导细胞活性氧水平增加作为上游信号启动了核因子κB凋亡信号通路。核因子κB是一个重要的核转录因子，在神经细胞凋亡的网络中起着枢纽作用，涉及的上下游信号分子众多，如IκB磷酸化和核因子κB解离的途径、蛋白水解及泛素化途径、过氧化物途径等，‘需要进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Activation of nuclear factor kappa B during heat stress-induced neuronal apoptosis

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